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设计使用或单个序列特异

性引物通过检测个手术切除的甲状腺肿瘤和非肿瘤样本以及个细针抽吸样本中的表达水平。相对于正常甲状腺组织计算表达水平。所有肿瘤都针对最常见的突变进行了基因分型。结果不同组织病理学类型的甲状腺肿瘤包括源自相同细胞类型的甲状腺肿瘤显示出显着不同的表达谱。 在无监督的层次聚类分析中嗜酸细胞肿瘤传统滤泡性肿瘤乳头状癌和髓样癌形成了不同的簇。

在乳头状癌中观察到表达模式与体细胞突

变之间存在显着相关性。一组七种和在甲状腺肿瘤中过表卡塔尔电子邮件列表达差异最大。手术样本中的增生结节在样本中得到了验证显示出甲状腺癌检测的高精度。结论在这项研究中我们证明了不同组织病理学类型的甲状腺肿瘤具有不同的谱同一肿瘤类型内的谱也存在差异反映了特定的致癌突变。 一组有限的可用于高精度诊断以检测手术和术前样本中的甲状腺癌。

问题部分内分泌护理代表最近发现的一类内源性非

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编码它们充当蛋白质编码基因表达的负调节因子,。失调在癌细胞中很常见并且越来越多的研究提供了参法国电报号码数据与癌发生的证据,。调节众所周知的癌基因和抑癌基因的表达,。已在各种癌症类型中鉴定出过度表达或下调的的特定子集这表明表达的异常可能在肿瘤的发生和进展中很重要,。

结论我们已经清楚地证明小檗碱通过

稳定启动子区域上形成的四链体结构来选择性抑制原癌基因的转录。 小檗碱存在时激活介导的下游信号通路也会下调从而通过细胞周期阻滞和细胞凋亡激活进一步抑制细胞增殖。因此基于其多样化的药理特性和活性小檗碱作为药物具有一定的潜力可以进一步开发用于治疗患者的临床前和临床研究也可以与其他激酶抑制剂联合治疗。

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鲁扎雷茨基德米特里加里宁阿纳托利波克罗夫斯基亚历山大戈洛维克乔治克拉斯诺夫玛丽亚费Portugal电子邮件列表多罗娃埃琳娜普多娃谢尔盖哈里托诺夫纳塔利娅梅尔尼科娃鲍里斯阿列克谢耶夫玛丽娜基塞列娃安德烈卡普林阿列克谢德米特里耶夫,端发生染色体重排所致位于染色体。 这产生了一种称为的截短融合蛋白其中基因的二聚化结构域介导同二聚体的形成随后酪氨酸残基磷酸化并激活下游信号通路。

甲状腺肿瘤的表达谱生物学意义和诊断实用性玛丽娜

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尼基福洛娃曾乔治大卫斯图尔特,唐娜迪奥里奥尤里尼基福罗夫《临床内分泌与代谢杂志》第卷第期年月格鲁吉亚电报号码数据日第,页发表年月日文章历史拆分视图引用权限图标权限分享图标分享抽象的目的表达在许多类型的人类癌症中失调。 我们试图研究在所有主要类型的甲状腺肿瘤包括携带不同致癌突变的肿瘤中的表达模式并探索分析在甲状腺结节术前诊断中的实用性。

尽管之前的研究已经证明了

小檗碱对细胞的抗增殖作用但小檗碱对基因表达的转录抑制作用尚未得到解决。 为了进一步确认小檗碱针对四链体结构的特异性我们利用介导与该结构结合的构效关系。的结构类似于小檗碱但由于异喹啉环中双键的饱和而具有叔胺基团由于失去π电子而改变了其平面性。这破坏了与四联体的结合潜力从而在细胞中不表现出任何生物活性。

这表明小檗碱对细胞中基因的抑制仅是由于其与

链体结构的相互作用并使其稳定。 在我们的研究中小檗碱通过抑制转录而显示出对基因表波兰电子邮件列表达的选择性影响而不会显着影响其他主要癌基因如和图这些基因的启动子区域也具有富含的序列,。一个合理的解释是细胞内四链体的形成在启动子区域比染色体中的其他区域更占优势这有利于小檗碱的特异性相互作用。

尽管小檗碱已被证明可以抑制表达其针对该癌基因

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的活性浓度比针对表达的活性浓度高几倍。 我们还表明在小檗碱存在的情况下细胞中致癌表达的破坏通过下德国电报号码数据调通路进一步抑制细胞增殖和活力进而激活细胞凋亡。通路也称为下游信号转导通路不受小檗碱抑制表明该通路可能受其他生长因子受体如等控制,或者长期暴露于小檗碱可能会抑制该通路。

基于体外获得的结果通过

生化和基于细胞的检测一种称为小檗碱的异喹啉生物碱已被确定为一种潜在的小分子可以结合并稳定四链体。 小檗碱对四链体结构的稳定也对启动子活性产生抑制作用这是通过启动子区域控制下的荧光素酶表达观察到的。测定进一步表明小檗碱阻止和与启动子区域的结合从而抑制该基因的转录。总的来说我们的数据表明小檗碱的细胞靶标可能是启动子区域形成的四链体结构。

基于靶点的药物发现中最具挑战性的问题

解决化合物与其靶点的特定相互作用。 因此重要的是证明基因近端启动子区域上菲律宾电子邮件列表四链体结构的形成是介导小檗碱的抑制作用所必需的。为了解决这个问题我们在研究中纳入了甲状腺乳头状癌细胞。与一样的发展也是由于蛋白以不依赖配体的方式组成型激活。然而该蛋白在中的功能获得性突变是由于激酶结构域编码区与含有基因的卷曲螺旋结构域,端发生染色体重排所致位于染色体。

这产生了一种称为的截短融合蛋白其中基因

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的二聚化结构域介导同二聚体的形成随后酪氨酸残基磷酸化并激活下游信号通路。由于染色体倒位基因加纳电报号码数据处于启动子区域的控制下其不具有盒区域因此不能形成四链体结构。在我们的研究中水平在小檗碱存在下并未降低这表明由于上存在四链体形成序列该化合物对具有高度特异性发起人。

细胞与不同浓度小檗碱孵育小

时后的流式细胞术分析显示在μ浓度下期细胞百分比增加表明期停滞图。 在高浓度的小檗碱μ下观察到凋亡细胞的增加这由与未处理的细胞相比处于亚期的细胞的较高百分比表示图。细胞凋亡的增加进一步伴随着期和期细胞百分比的下降这清楚地表明小檗碱通过期阻滞诱导细胞凋亡图。为了进一步证实小檗碱介导的细胞周期停滞测定了细胞周期调节蛋白的表达。

视网膜母细胞瘤蛋白在期的磷酸化释放转录因

子进而反式激活细胞周期蛋白这是进入期所需的。 如图所示在小檗碱存在下磷酸化的和细胞周期蛋白秘鲁电子邮件清单的表达显着降低这清楚地表明细胞周期停滞。讨论我们研究的主要目的是强调通过使用小分子沉默基因转录来特异性治疗的治疗策略。尽管小干扰的使用已被开发为一种有前途的沉默基因表达策略但将开发为药物样分子仍存在一些缺陷。

带负电荷且尺寸较大阻碍其渗透到靶细胞的质

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膜中而且它们非常容易被细胞外区域中存在的酶降解从而降低其治疗潜力。 因此使用易于扩散希腊电报号码数据到细胞膜并抑制基因表达的小分子抑制剂克服了这些陷阱和挑战。基因启动子区域上四链体结构的形成所产生的转录抑制作用使我们能够使用小分子来稳定该二级结构以抑制基因表达。

表达介导的细胞效应由于是一

种生长因子受体主要参与介导细胞增殖和活力因此我们通过法检测了小檗碱对细胞系生长的影响。如图所示细胞的活力随着小檗碱浓度的增加而降低并且发现暴露小时后约为μ。 这清楚地表明表达在调节细胞增殖和活力中发挥着重要作用。图图细胞中表达介导的细胞效应。对细胞进行测定用浓度不断增加的小檗碱处理小时以确定细胞活力。

在暴露于不同浓度的小檗碱后测定

细胞中和的磷酸化状态。在增加小檗碱浓度的情况下测定细胞中的巴布亚新几内亚电子邮件列表和活性。用不同浓度的小檗碱处理小时的细胞的分析。数据是三个独立实验的平均值。 分析以确定细胞中的蛋白表达全尺寸图像我们通过确定的有丝分裂信号通路是否受到抑制进一步表征了小檗碱抑制细胞增殖的机制。将细胞暴露于小檗碱后测定和的磷酸化状态因为它们是参与致癌激活的信号转导途径的主要激酶。

如图所示小檗碱以剂量依赖性方式抑制的磷酸化

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而磷酸化的水平没有改变。这表明小檗碱对细胞中表达的抑制导致通路的下调。 接危地马拉电报号码数据下来我们通过确定小檗碱对该途径下游靶标的影响研究了磷酸化水平的降低如何有助于抑制细胞增殖。根据之前的报道促生存途径激活抗凋亡从而阻止激活。有趣的是小檗碱降低了细胞中的表达这反过来表明与未处理的细胞相比活性增加了倍图。

如图所示测定显示小檗碱阻止

和与启动子结合这表明四联体相互作用剂可能干扰启动子区域的转录复合物组装。对启动子活性的影响是类似物之一其结构与小檗碱非常相似。 然而异喹啉环中的饱和双键可能会改变其芳香性从而中断其与四联体的结合图。在不存在和存在卡纳定当量的情况下获得了四链体在升高温度下的光谱。

正如预期的那样在添加当量后四链体结构的

没有显着增加图表明不能稳定启动子区域中形成的四链体结构。图图对四巴拿马电子邮件列表链体稳定性和启动子活性的影响。小檗碱和卡纳丁的结构。在不存在和存在卡纳定当量的情况下随着温度从°升高到°μ的滴定谱。 四链体在不存在和存在卡纳定当量的情况下的熔解曲线。不同浓度的处理小时后对细胞系中荧光素酶表达水平的影响。

在增加浓度的孵育小时后对细胞中蛋白表达的影响

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尺寸图像接下来我们通过测量不同浓度的卡纳定存在下细胞中的荧光素酶表达水洪都拉斯电报号码数据平来研究卡纳定与小檗碱对基因启动子活性的影响是否存在差异。如图所示即使在μ暴露小时后也没有观察到荧光素酶水平的显着降低。 用处理小时后细胞中的蛋白表达水平也没有降低图。总体而言这些数据表明小檗碱对启动子区域四链体结构的稳定对于抑制基因转录非常重要。

在处理后在不存在和存在当量

小檗碱的情况下通过在四链体形成序列上形成的平行四链体的示意图模型分别为泳道和。 分析以确定在两种不同浓度暴露小时后小檗碱将和募集到细胞启动子区域的盒区域的效果。使用启动子特异性引物通过评估和向近端启动子区域的募集情况。的输入用作内部对照同种型匹配的用作免疫沉淀的阴性对照全尺寸图像为了验证我们的预测我们通过足迹研究了小檗碱与和富含序列的相互作用模式。

足迹法是一种众所周知的技术用于确定参

与四链体形成的鸟嘌呤碱基。 这些鸟嘌呤的位置参与碱基配对形成四分体并通过保护免受甲基化,。如图泳道所示在存在下由序列产生的鸟嘌呤甲基化模式与两个分子内平行四链体各自包含三个四联体一致阿曼电子邮件列表模型,。如图所示。泳道添加小檗碱当量后鸟嘌呤甲基化模式与单个分子内平行四链体一致如图模型所示表明小檗碱与四链体的结合将它们转化为单一构象。

根据在不存在和存在小檗碱当量的情况下

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序列上的足迹四联体小檗碱复合物中的鸟嘌呤图泳道清楚地显示与未结合的四匈牙利电报号码数据联体图泳道相比增强的切割。 这清楚地表明小檗碱与启动子区域上的敲除突变序列的相互作用。为了进一步了解小檗碱抑制表达的细胞机制我们进行了染色质免疫沉淀测定以研究小檗碱对细胞中和占据启动子的影响。

由于染色体重排该细胞系中的基因表达

受到基因启动子区域的控制,该区域缺乏四链体形成基序。如图所示在小檗碱存在下暴露小时后表达并未显着降低。该数据清楚地表明的近端启动子区域上存在四链体形成序列基因在介导小檗碱对基因表达的影响中起着关键作用。 小檗碱对启动子活性的影响为了研究小檗碱是否通过四链体稳定化抑制其启动子活性来抑制基因表达使用了两种同基因细胞系和其中荧光素酶报告基因的表达分别受到野生型和敲除突变体启动子区域的控制。

如图所示在小檗碱μ存在的情况下在两种细

胞系中观察到荧光素酶表达降低约%。这表明小檗碱的抑制作用挪威电子邮件清单与上形成的四链体结构无关。 启动子区因为细胞系中的序列无法形成此结构。根据这些数据我们预测小檗碱可能能够结合启动子区域的序列并可能形成未知的结构通过该结构抑制基因启动子活性。图图小檗碱对基因启动子活性的影响。

小檗碱处理小时后对和细胞系中荧光素酶表达的影

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响。细胞裂解物中的荧光素酶活性以相对发光单位进行测量并标准化为总蛋白冰岛电报号码数据含量。实验一式三份进行。 误差条代表平均荧光素酶活性百分比上方和下方个标准差。乙处理后在不存在和存在小檗碱当量的情况下四链体形成序列上的足迹分别为和泳道。嘌呤和嘧啶测序充当单碱基梯以鉴定哌啶处理后受保护和切割的鸟嘌呤分别为泳道和。

在小檗碱当量存在下增加至约

°图表明小檗碱可以稳定四链体。图图光谱研究验证四链体与小檗碱的稳定性。在不存在和存在小檗碱浓度不断增加的情况下μ的滴定谱在不存在和存在小檗碱当量的情况下随着温度从°升高到°μ的滴定谱。 四链体在不存在和存在小檗碱当量的情况下的熔解曲线全尺寸图像小檗碱选择性抑制细胞中的由于我们的体外研究表明小檗碱是一种潜在的小分子可以与启动子区域上形成的四链体结构相互作用并稳定其因此我们接下来使用体外细胞测定法检查了小檗碱对表达的影响。

我们的研究选择细胞系因为该细胞系中原癌基

因的表达受到含有富含序列的启动子区域的控制其采用四联体结构。 如图所示小檗碱降低在μ的无毒浓度下暴露小时和小时后基因表达分别超过和。根据蛋白质印迹分析蛋白表达也减少图。图图小檗碱对和细胞系中表达的影响尼日利亚电子邮件清单。不同浓度的小檗碱处理和小时后对细胞中表达的影响。

在暴露于浓度增加的小檗碱和小时后通过蛋白质

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印迹法测定细胞中的蛋白表达。在暴露于不同浓度的小檗碱小时后确定小檗碱对细胞中表喀麦隆电报号码数据达的影响。 存在不同浓度小檗碱并暴露长达小时时细胞中和的蛋白表达水平全尺寸图像为了进一步探讨基因启动子区形成的四链体结构是否是小檗碱的细胞内靶标使用甲状腺乳头状癌细胞。

如我们之前的报告所述在用不

同浓度的小檗碱处理小时后对细胞进行分析。结果小檗碱与四链体的体外相互作用在这项研究中我们首先使用聚合酶终止测定检查了小檗碱及其结构类似物图与四链体的相互作用。在此测定中模板上四链体等二级结构的形成或这些结构的配体介导的稳定预计会在引物延伸过程中阻止聚合酶的进展。

如图所示在小檗碱存在的情况下观察到被抑制产物

的量呈剂量依赖性增加表明该化合物在其类似物中与四联体的相互作用最强。 为了进一步验证四链体与小檗碱的稳定性在不存在和存在小檗碱的情况下对序列进行光谱分析。首先我们通过监测小檗碱不存在和存在浓度增新西兰电子邮件列表加的情况下的圆二色光谱来确定小檗碱的结合是否改变四链体结构的结构构型。

如图所示随着小檗碱浓度的增加序列μ的滴定不会影

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响处的峰表明小檗碱不会改变四链体结构的平行构型。接下来我们通过监测在升高温度下智利电报号码数据不存在和存在小檗碱当量的情况下的圆二色光谱来确定小檗碱的结合是否稳定四链体结构。 如图所示随着温度从℃升高到℃处最大峰的强度逐渐降低在,℃时观察到降低了%这对应于其熔化温度图。

产物在琼脂糖凝胶电泳上进

行分析。蛋白质印迹法制备全细胞提取物并在梯度聚丙烯酰胺上解析蛋白质如前所述。使用的一抗如下抗抗抗和抗购自,抗抗抗产品抗抗抗抗抗抗细胞周期蛋白和抗购自抗肌动蛋白购自。 使用与辣根过氧化物酶缀合的小鼠或兔抗体作为二抗。使用增强化学发光试剂盒来检测发光。荧光素酶测定暴露小时后用不同浓度的小檗碱处理同基因细胞系和。

根据制造商的说明使用荧光素酶测定系

统暴露于小檗碱后测定荧光素酶表达水平。染色质免疫沉淀分析如前所述使用进行测定以确定和与启动子区域的结合。使用单克隆小鼠抗和单克隆小鼠抗进行免疫沉淀。 使用启动子正向引物,对和的结合进行定巴林电子邮件列表量。反应包括在°下初始变性分钟然后在°秒°秒和°秒进行个循环如前所述。

产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析细胞活力测定将

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细胞以个细胞孔的浓度铺在孔板中并孵育过夜然后暴露于各种浓度,μ的化合物中长中国电报号码数据达和小时。如前所述使用染料测定细胞活力。使用多重检测酶标仪在处测量吸光度。测定和流式细胞术用不同浓度的小檗碱处理细胞长达小时并使用荧光检测试剂盒按照制造商的方案测量活性。